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在珊瑚海海战之后，赵继统和山本五十六策划了一个庞大的“中途岛作战计划”，其意图在于进一步摧毁美军舰队以便日本海军可以在太平洋岛链上专心巩固防御。山本认为必须尽早进行这类决定性战役。
该战役计划包括一次佯攻作战:派遣第五舰队(包括轻型航母两艘，巡洋舰五艘，驱逐舰十三艘，运输船四艘)进攻阿留申群岛，空袭荷兰港并进一步入侵基斯卡岛和阿图岛，山本相信这次攻击足以将美国舰队--可能包括航母--从珍珠港吸引到北方。这次作战其实是山本为换取军令本部的支持而发动的与中途岛作战平行的作战行动。
当第五舰队攻击阿留申群岛时，第一突击编队(包括舰队航母四艘，战列舰二艘，巡洋舰三艘，驱逐舰十二艘)将对中途岛发动空袭并摧毁后者的空中力量。上述行动完成后，第二舰队(轻型航母一艘，战列舰二艘，巡洋舰十艘，驱逐舰二十一艘，运兵船十一艘)将派出5000步兵从美国海军陆战队手中夺取中途岛环礁。上述对中途岛的占领行动会将美国航母编队重新吸引向西方，而第一突击编队将设下埋伏将它们歼灭。
此后，第一舰队(轻型航母一艘，战列舰七艘，巡洋舰三艘，驱逐舰十三艘)将与第二舰队的部分兵力会合，共同将剩余的美国海军太平洋舰队兵力聚歼。为应对突发情况，山本设置了两项预警措施。第一项是派出海军重型水上飞机川崎二式大艇对珍珠港进行远程空中侦察，确保美军航母正在港内待命，称为“k作战”；第二项是设置潜艇防线，以便在美军航母前往中途岛时尽早向第一突击编队、第一舰队和第二舰队通报敌方的行动。
但实际上，空中侦察行动因故取消（后详），潜艇也推迟到美军航母已经出击后方才就位。中途岛战役的作战计划制定过程充满妥协和匆忙(为赶在对马海峡海战纪念日暨日本海军节当日派出舰队）但在日军看来，计划本身颇为周详，组织严密，时机掌握得也很好。
相对于日军计划投入决战的四艘舰队航母，二艘轻型航母，十一艘战列舰，十六艘巡洋舰和四十六艘驱逐舰，美国海军只拼凑得出三艘航母、八艘巡洋舰和十五艘驱逐舰，可见兵力悬殊。交战双方只在大型航母数量，可供调动的飞机数量以及潜艇数量上才较为接近。从计划上看，如果不出意外的话，日本将拥有一面倒的巨大优势。
对于指挥官来说最可怕的事莫过于敌人对自己的作战计划了如指掌，而赵继统的存在恰好做到了这一点。美方不但知道了全盘的作战计划，更早已掌握了日本海军d号密码(美军称为jn-25)，美国太平洋舰队司令切斯特·威廉·尼米兹海军上将成功地破解了山本设下的两项预警措施并将美方仅有的部队配置在最适合对日军航母实施伏击的位置上。
据尼米兹上将计算，他的三艘大型航母再加上中途岛机场，勉强足够与南云指挥的第一突击编队抗衡。在五月份接报有日军水上飞机进行骚扰性空袭之后，尼米兹立刻派遣一艘扫雷艇前去守卫日军计划给参加k作战的水上飞机加油的地点，导致侦察行动取消，山本无法确定美军航母是否一直在珍珠港里待命(山本派出的骚扰性空袭，引起了美军的警觉)。
尼米兹也提早派遣美军航母离港，赶在山本的潜艇警戒线成型以前进入伏击地点，使山本的所有预警措施归于无效。日军按时对阿留申群岛展开了象征性的攻击，但美军航母专心设伏，没有被引诱北上。山本本以为美军航母要在数日之后才能赶来救援中途岛，没想到凌晨，南云忠一海军中将率第1机动编队（航空母舰4艘、舰载机260多架、其他作战舰艇17艘）进至中途岛西北240海里海域，4时30分派出第1波飞机108架飞往中途岛。
岛上美军发出警报，飞机升空迎敌，展开激战。日军轰炸机袭击机场，炸毁部分地面设施。由于岛上防御得到加强，机场跑道未被摧毁。在此期间，南云的机动编队多次受到美军岸基飞机的侦察、袭扰和攻击。南云遂决定再次攻击中途岛。7时15分，美军岸基机结束攻击，南云却下令已挂上准备攻击美国航空母舰的第2波飞机改装攻击中途岛。
7时28分，日军侦察机报告发现美国舰队。此时，在中途岛东北海域待机的美国特混舰队正向日机动编队接近，并已派出第一、第二波飞机200多架。8时20分，日本侦察机报告美国舰队似有1艘航空母舰。南云于是命令攻击中途岛的第一波飞机和担任空中战斗巡逻任务的战斗机返航，随后率领舰队北驶，以免遭到袭击，并重新部署对敌舰队的攻击。
约9时20分于10时26分，正当日军第2波飞机正在卸下、重挂的混乱之际，美国舰载机和俯冲轰炸机连续攻击南云的航空母舰。日方虽有部分战斗机临空迎战，但为时已晚。日军损失航空母舰4艘（“赤城号”、“加贺号”、“苍龙号”、“飞龙号”）、重巡洋舰1艘、飞机285架，人员3500名；美军损失航空母舰1艘（“约克敦号”）、驱逐舰1艘、飞机约150架，人员307名。
鉴于第1机动编队损失惨重，山本于5日下令停止中途岛作战，率联合舰队西撤。美军乘势追击，于6日派舰载机3次出击，又击沉日军重巡洋舰1艘，击伤巡洋舰、驱逐舰数艘。鉴于航空兵力已经全灭而水面舰艇又尚未为一场舰队决战集结完毕，山本试图重新配置他那在数量上仍旧强大的舰队来埋伏美军舰艇。
但是他原来的计划将水面舰艇配置得过于远离中途岛，而且美军指挥官雷蒙德·斯普鲁恩斯海军中将基于一份来自情报部门的报告，谨慎地早早向东撤退而并未中伏。斯普鲁恩斯并不知道日军阵列中拥有包括大和号在内的数艘战列舰，如果在中途岛进行夜战他的航母和巡洋舰将处于不利的位置。
此时山本准确地判断他已没有胜算，遂宣布放弃占领中途岛的任务并全军撤退。这次失败使山本持续六个月的成功历程告一段落，日军的扩张也到此为止。